[분자생물학] 유전 공학 기술과 응용 (클로닝/PCR/사슬종결법/마이크로어레이 등)

유전자 클로닝

유전자 클로닝은 동일한 DNA를 대량 복제하는 기술로, 세균 플라스미드에 복제할 DNA 부위를 제한효소로 잘라 플라스미드에 삽입하여 재조합 DNA를 만들고, 이를 세균에 형질전환 및 증식시켜 얻어낼 수 있습니다.

 

** 제한효소가 인식하는 염기서열은 회문구조를 가지고 있습니다.

** 제한효소 1개만을 사용하면 유전자가 뒤집혀 들어갈 수도 있으므로,

    제한효소 2개를 사용하여 점착 말단과 무딘 말단이 모두 있도록 자릅니다.

 

 

벡터

벡터는 유전물질 운반자로 사용되는 DNA 분자로, 목적에 따라 클로닝 벡터, 거기에 더 추가한 발현 벡터 등이 있습니다.

벡터로 사용될 수 있는 것들에는 세균 플라스미드, BAC(세균인공염색체), Ti 플라스미드(식물용 벡터) 등이 있습니다.

복제원점(ori)과 선택적 표지자가 있어야하며, MCS(제한효소 인식 부위)는 (조각이 나지 않도록) 하나만 있어야 합니다.

 

ex ) 항생제 저항성(AmpR, TerR)이 있으면 항생제를 처리하여 세균에 유전자가 전달이 되었는지 확인이 가능합니다.

 

플라스미드 분리를 수행할 때는 SDS로 세포막을 파괴하고, NaOH를 처리하여 pH를 증가시켜서 DNA 변성을 일으킨 뒤, 아세트산칼륨을 처리하여 pH를 다시 낮추는 과정을 거치면 상층액에 작은 플라스미드들만 위치하게 되고 이 때 RNase로 RNA를 제거해줘야 합니다.

 

[유전학] 세균의 형질 전환과 형질 도입, Hfr

↑ 세균의 형질 전환 방법과 관련해서는 위의 포스트를 참고해주시면 됩니다.

 

 

유전자 도서관

gDNA 도서관은 저장할 유전자 전체를 제한효소로 절단 후 벡터에 삽입하여 보관하는 기술입니다.

 

cDNA 도서관은 특정 단백질을 암호화하는 mRNA 부위에만 역전사효소를 처리하여 합성한 cDNA를 벡터에 삽입합니다.

+ mRNA 3' poly A tail에 결합하는 올리고dT 프라이머를 처리하고 역전사효소를 첨가하여 한 가닥을 먼저 합성하고,

   RNase를 처리하여 RNA 가닥을 제거한 뒤, DNA Polymerase I, Ligase를 차례로 처리하여 이중 가닥을 완성합니다.

  (물론 RNA가 일부 남아있어야 DNA Polymerase가 작용할 수 있음)

 

유전자 스크리닝은 유전자 도서관에서 찾으려는 표적 유전자를 골라내는 작업으로,

클론을 배양하여 형성되는 콜로니들 중에서 (상보적 서열인) 핵산 탐침을 이용하여 형질 전환된 콜로니를 찾습니다.

 

이 때 알칼리를 처리하여 DNA를 단일 가닥으로 만들고, 자외선/고열을 처리하여 핵산을 여과지에 고정하고,

상보적 서열을 가지는 탐지자를 사용하여 엄격성(결합한 탐지자가 목적 서열일 확률)을 높입니다.

 

** 엄격성을 증가시키려면 탐지자의 길이가 길거나, 염 투여(핵산 음전하 사이 반발 감소)가 안 되어 있거나, 고온 처리가 되어 있어야 합니다.

 

 

PCR

PCR(중합효소연쇄반응)은 DNA 일부 서열을 2^n배로 단기간에 증폭 복제시키는 기술입니다.

 

먼저 고온 처리를 하여 이중 가닥의 분리를 발생시킵니다. (짧아서 Helicase와 다르게 지연 사슬이 형성되지 않습니다.)

온도를 낮춰 식히고 DNA Primer를 부착시킵니다.

(효소를 사용하지 않아도 된다는 장점이 있지만, 상보적 서열을 알아야 한다는 단점이 있습니다.)

dNTP 염기들을 넣어주면 각각의 단일 가닥에 대해 상보적 이중 가닥이 합성됩니다.

(이 과정을 일반적으로는 3회 이상, 특이적 프라이머를 사용할 시에는 2회 수행합니다.)

 

RT-PCR(역전사 PCR)은 mRNA를 기반으로 cDNA를 증폭시키는 기술입니다.

 

PCR의 한계점은 증폭 속도가 매우 빨라서 뉴클레오티드가 부족하며 정량적 분석이 어렵다는 점입니다.

해결책은 Taq DNA Polymerase를 이용해 3' 말단에 Poly A를 첨가하여, 클로닝을 이용하는 것입니다.

 

 

전기영동 (RFLP, 블로팅)

[유전학] 세균(콜로니)과 바이러스(플라크)의 관찰 + RFLP, 블로팅

↑ RFLP와 블로팅에 대한 기본적인 개념은 위 포스트의 하단부를 참고해주세요.

 

RFLP는 사람마다 제한효소를 처리하여 수행한 전기영동에서 나타나는 절편들이 다르다는 특성을 이용하는 것입니다.

점 블로팅은 전기영동 없이 DNA(+ 형광 표지 탐침)을 반응시켜 DNA를 찾는 방법입니다.

서던 블로팅은 DNA, 노던 블로팅은 mRNA(+ DNA 탐침), 웨스턴 블로팅은 단백질(+ 항체)을 이용한 전기영동입니다.

 

** 서던 블로팅은 RFLP를 수행 후, HCl/HNO3를 처리하여 탈퓨린화를 해준 뒤(이동 쉬워짐), 알칼리 용액을 처리합니다.

   모세관 현상을 이용하며, 고정 시 BSA(소혈청알부민, 항체/핵산 탐지자와 비특이적 결합을 하지 않음)를 덮습니다.

** 웨스턴 블로팅도 BSA를 이용하지만, 모세관 현상을 이용하지 않고 전극을 이용합니다. (단백질 + beta-ME + SDS)

 

+ 핵산을 전기영동 시킬 때는 전압차를 작게 유지해주어야 합니다.

 

 

DNA 지문

DNA 지문은 사람마다 다르게 나타나는 염기서열의 특성을 말합니다.

범인을 찾거나 쌍둥이를 찾는 작업 등에 활용됩니다.

RFLP를 사용하거나, 중간빈도 반복서열 VNTR/STR을 이용할 수도 있습니다.

 

 

크리스퍼 유전자 가위

크리스퍼 유전자 가위는 세균에서 발견되는 적응 면역 메커니즘을 응용한 유전자 편집 기술입니다.

CRISTPR 서열은 바이러스에 감염되면 방어 기작을 자손에 유전시키는데, 이 때의 Guide RNA 서열을 말합니다.

이 기술을 이용하여 표적 DNA 서열을 가진 세포에, 이 RNA를 주입할 수 있는 것입니다.

Cas9(목적 DNA를 절단하는 효소)와 sgRNA(편집할 부위와 상보적인 서열을 가지는 Guide RNA)를 이용합니다.

 

+ (윤리적 문제가 발생할 수 있으므로) 유전병(돌연변이)을 교정하기 위한 목적으로만 사용합니다.

 

 

사슬 종결법

사슬 종결법은 ddNTP를 이용하여 DNA 염기 서열을 찾는 방법입니다.

ddNTP는 dNTP의 3' 탄소에 OH 대신 H가 있어 DNA Polymerase에 의해 연결되지 못합니다.

주형 DNA에 프라이머만 붙은 상태로 (4개의) 형광 표지 ddNTP 시험관에 넣고 반응시킨 뒤 전기영동으로 확인해보면,

멀리 이동한 것부터 하나씩 염기 종류를 확인할 수 있습니다. (방법은 여러 가지가 있음)

이 서열에 대해 상보적인 서열이 주형 DNA 가닥의 염기 서열이 되는 것입니다.

 

 

마이크로어레이

마이크로어레이는 mRNA를 역전사시켜 만든 형광 cDNA 탐침으로 유전자 발현도를 확인하는 기술입니다.

예를 들어 두 그룹에서 추출한 mRNA를 서로 다른 형광 dNTP로 역전사시킨 뒤, 여러 개의 DNA 마이크로어레이 칸들에 반응시켜서 나타나는 색을 가지고 어떤 그룹에 대해 더 많이 발현되는 유전자인지 알 수 있습니다.

 

 

RNAi

RNAi는 mi/siRNA와 결합한 RISC 복합체가 표적 mRNA에 결합 및 가수분해하여 단백질 합성을 저해하는 기작입니다.

↓ 아래의 포스트에 정리되어 있습니다.

[분자생물학] 진핵 생물의 유전자 발현 조절 (염색체 응축, 전사 조절 인자, RNAi)

 

 

유전자 knockout

유전자 knockout은 네오마이신 저항성 유전자를 표적 유전자에 삽입하여 아예 발현되지 않도록 하는 기술입니다.

 

유전자 결손 생쥐 실험이 대표적입니다.

플라스미드에 유사 표적 DNA를 만들고 저항성 유전자를 삽입하여, 이것을 쥐의 배아줄기세포에 삽입합니다.

그 다음 플라스미드와 쥐의 염색체 사이에 상동 재조합이 일어나도록 한 뒤 검정색 쥐에 이식합니다.

그러면 일부의 모자이크 생쥐를 얻을 수 있고, 이를 야생형 생쥐와 교배시켜 얻은 이형접합 생쥐를 자가교배하여,

1/4의 확률로 완전히 형질전환 된 생쥐를 얻을 수 있습니다.

 

↓ 보충 설명은 아래 링크를 참고해주세요.

넉아웃 마우스 - 나무위키

 

 

단백질 상호작용 분석

EMSA는 DNA에 단백질이 결합했을 때 이동거리가 감소한다는 특징을 이용한 전기영동입니다.

↓ 아래 포스트의 중간에 정리되어 있습니다. (진핵 생물 번역 전사 개시 과정에서의 복합체 분석에 사용됨)

[분자생물학] DNA 전사 과정과 특성 (개시, 신장, 종결)

 

염색질 면역침전법은 DNA 결합 단백질에 대한 항체를 반응시켜 침전시킨 뒤, 해당 DNA 서열 또는 결합 단백질을 분석하는 것으로, 전사 조절을 분석할 수 있습니다.

 

친화성 크로마토그래피는 단백질에 결합하는 단백질을 분석하는 방법입니다.

↓ 아래 포스트의 친화성 크로마토그래피 부분에 정리되어 있습니다.

[세포생물학] 단백질 : 아미노산의 종류와 특성, 단백질 구조, 분리정제학(전기영동)

 

파지 디스플레이는 파지 표면에 항체를 발현시켜 특정 세포만 파괴하는 항체를 찾는 방법입니다.

면역학 파트에서 자세히 다룹니다.