[세포생물학] 단백질 : 아미노산의 종류와 특성, 단백질 구조, 분리정제학(전기영동)

섬유성 단백질은 콜라겐과 같이 골격과 구조를 형성하며, 구형 단백질은 효소와 같이 기능을 수행합니다.

 

 

아미노산의 종류와 특성

첫 번째, 아미노산의 등전점에 대해 알아야합니다.

↓ 이에 대한 내용은 아래 포스트를 참고해주세요.

[세포생물학] 아미노산 완충 구간과 등전점 / 아미노산 용액 적정 그래프 해석

 

두 번째, 소수성 아미노산에 대해 알아야합니다.

 

글리신(Gly), 알라닌(Ala), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 발린(Val), 프롤린(Pro)은 R이 직선형 탄화수소인 아미노산입니다.

+ 알라닌, 류신, 이소류신, 발린 4개가 α-나선을 가장 잘 형성합니다.

 

** 4칸 떨어진 아미노산 사이에 O-H 인력이 작용합니다. (인접 아미노산 사이에서 작용하는 것이 아님)

 

아미노산의 COOH의 OH와 NH2의 H가 떨어지면서 탈수축합반응이 일어나고 펩티드 결합을 형성합니다.

이 때 펩티드 결합은 회전이 불가능하다는 특징이 있습니다.

결합 이후 C=O의 O는 음전하를 띠고 NH의 H는 양전하를 띠기 때문에 인력이 작용합니다.

이러한 수소와 산소 사이의 인력이 단백질의 α-나선 구조를 "형성"하는 것입니다.

α-나선 구조가 형성이 된 이후에는 R그룹과 주변의 소수성 환경 사이의 상호작용에 의해 구조가 "유지"됩니다.

 

글리신은 R그룹에 탄소 C가 없고 따라서 주변의 환경과 소수성 상호작용을 하지 않습니다.

프롤린은 R그룹과 같은 아미노산의 질소 N이 이미노 결합을 하여 이미노기를 가지고 있습니다.

즉, 질소가 R기를 구속하고 있어서 다른 아미노산과 상호작용을 할 수도 없고, 따라서 α-나선도 형성하지 않으며 이미노기 때문에 급하게 꺾이는 구조를 가지고 있습니다. (beta 병풍 구조, 강도가 존재함)

 

비극성 R기를 가지는 소수성 아미노산들은 단백질의 내부에 존재하여,

기능을 수행 = 3차 구조를 유지 = 외부에 친수성 아미노산이 위치하여 친수성 성질을 가짐 = 용해도가 높습니다.

(<-> 기능이 파괴 = 3차 구조 유지 못함 = 외부에 소수성 아미노산이 노출되어 소수성 성질을 가짐 = 용해도가 낮음)

 

페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr), 트립토판(Trp)은 고리형 아미노산(방향족 R기)입니다.

이 아미노산들은 이중결합과 단일결합을 반복한다는 특징이 있어서 280nm에서 자외선 흡광이 발생합니다.

+ 용액 속에 용해되어 있는 단백질의 흡광도를 계산할 때 반드시 용액흡광도까지 고려하여 계산해주어야 합니다.

티로신은 방향족 + OH기를 가지고 있어서 페닐알라닌과 트립토판에 비해 약간의 친수성 성질을 가지고 있습니다.

 

메티오닌(Met)은 중간에 황(S)을 가지고 있고 단백질 번역 개시 아미노산입니다.

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나머지 아미노산들은 모두 친수성 아미노산입니다.

 

세린(Ser), 트레오닌(Thr)은 OH기가 있습니다.

이러한 OH기를 가진 아미노산의 경우 탈수 축합 반응이 가능하기 때문에 인산기를 붙일 수 있습니다.

따라서 반응 과정에서 인산기를 전달해주는 단백질들은 모두 세린 또는 트레오닌을 가지고 있음을 알 수 있습니다.

 

시스테인(Cys)은 -SH기가 있습니다.

이 시스테인 2개에 산화 작용을 일으키면 이황화결합이 형성되며, 3차 구조를 형성하는 가장 강력한 힘입니다.

이 때 시스테인의 산화 작용은 조면소포체(RER)에서만 발생합니다.

역으로 생각하여 이황화결합이 있는 단백질은 반드시 조면소포체를 거친 단백질임을 유추할 수도 있습니다.

(즉, 자유 리보솜에서 단백질을 합성하는 경우에는 해당하지 않음)

조면소포체에서는 산화 상태 (즉 산화 상태니까 수소를 배출하고 환원되며 결합이 형성됨), 세포질에서는 환원 상태인 것입니다. (즉 환원 상태니까 수소를 받아서 산화되며 결합이 깨짐)

관련 개념으로 NEM, DTT, NEM 처리에 따른 이황화결합 추적 과정이 있습니다. (이전에 다룸)

 

히스티딘(His)"의 pH 6~7 사이에서 완충 기능을 가지고, 이는 체내 pH와 비슷하므로 체내 완충작용에 사용됩니다.

 

+ 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln)은 R기에 아미노기(-NH2)를 가지고 있습니다.

+ 리신, 아르기닌, 히스티딘은 작용기가 양전하를 띱니다.

+ R기에 +전하를 가지고 있는 아미노산은 DNA에 결합하는 성질이 가장 높습니다.

+ 내재성 막관통영역에서 발견될 가능성이 가장 높은 아미노산은 소수성 아미노산입니다.

+ 280nm 파장의 빛을 가장 잘 흡수하는 아미노산은 방향족 고리를 가집니다.

+ 인산기 첨가 가능한 아미노산은 OH기를 가집니다.

 

 

단백질의 구조

단백질의 구조는 1차~4차 구조로 구분됩니다.

 

1차 구조는 말 그대로 최소 단위인 아미노산들이 카르복실기와 아미노기의 탈수 축합 반응에 의해 형성되는 펩티드 결합에 의해 연결되는 구조를 말합니다. 또한 1차 구조는 단백질의 최종적인 기능의 형태인 3차 구조에까지 지배적입니다.

 

ex ) 겸형 적혈구 빈혈증은 아미노산 서열의 글루탐산이 발린으로 바뀌어 나타나고, 이는 소수성 아미노산이므로 적혈구의 형태가 겸형으로 변형됩니다.

ex ) 3차 구조 정보 또한 1차 구조에 포함되어 있으므로, 단백질이 변성되어도 3차 구조 정보가 사라지지 않습니다.

 

2차 구조는 크게 α-나선 구조와 beta 병풍 구조가 있는데 beta 병풍 구조는 강도가 존재한다는 정도만 알고 있으면 되고, α-나선 구조는 위에서도 언급했듯 형성은 4개 떨어진 아미노산들 사이의 수소결합, 유지는 R기와 외부 소수성 환경과의 상호작용에 의한 것임을 알고 있으면 됩니다.

 

폴리펩티드의 α-나선 구조는 대략 아미노산 4개마다 1회전을 구성합니다. 예를 들어 아미노산을 한쪽 끝부터 1, 2, 3, ... 순서로 번호를 매긴다고 할 때 1, 5, 9, ...번의 아미노산들은 같은 쪽 측면에 있는 아미노산들임을 알 수 있습니다.

 

막관통단백질은 수용체 단백질과 수송단백질로 나누어지는데, 수용체 단백질은 모두 소수성 아미노산들로 구성되어있고 수송단백질은 가운데 통로 부분은 물 역시 지나가기 때문에 친수성 아미노산으로 이루어져 있습니다.

 

예를 들어 아미노산 서열을 알려주고 수용체 단백질인지 수송단백질인지 구분해야하는 상황일 때 1, 5, 9, ... / 2, 6, 10, ... / 3, 7, 11, ... / 4, 8, 12, ...라인 중 친수성 아미노산이 포함된 라인이 있다면 해당 부분은 수송단백질의 통로 쪽에 해당하는 아미노산들임을 유추할 수 있습니다.

 

α-나선, β-병풍 구조 등의 섬유상 단백질들은 모두 불용성이고, 구형의 단백질만이 외부에 친수성 아미노산과 내부에 소수성 아미노산을 구성하여 친수성으로 용해도가 높습니다.

 

3차 구조는 R기 사이의 이온결합, 수소결합, 소수성 상호작용 및 공유결합(이황화결합) 등이 해당되고 2차 구조 이상으로 복합적으로 접히는 형태를 말합니다. (3차 구조의 결함의 예시로 섬유성 낭포증이 있습니다.)

단백질의 기능이 저하되면 소수성 아미노산이 바깥으로 노출되고, 그러면 단백질의 용해도가 낮아집니다.

* 이황화결합이 많다고 해서 단백질이 안정한 것이 아닙니다. 이황화결합의 수는 효소의 안정성에 반비례합니다.

 

* Anfinsen의 실험 : 단백질의 1차 구조가 3차 구조를 지배한다는 결론을 보여주는 실험입니다.

단백질의 3차 구조에 특정 변성요인(beta-MercaptoEthanol과 요소)을 가하면 1차 구조로 변성이 되고, 다시 1차 구조에 요소, beta-ME "순서대로" 제거하면 구조가 복원이 됩니다. (이 때 beta-ME부터 제거할 경우 요소가 이황화결합의 재형성을 방해하기 때문에 3차 구조 복원이 제대로 되지 않습니다. 따라서 요소부터 제거해주어야 합니다.)

 

샤페론은 단백질의 3차 구조 형성에 도움을 주는 단백질입니다.

여기에는 PDI라는 보조 단백질이 필요한데, PDI는 조면소포체에서 이황화결합을 형성하는 기능을 합니다.

또한 샤페로닌이라는 보조 단백질도 있는데, 샤페로닌은 열충격단백질(HSP)로써 열이 발생하면 단백질이 변성되지 않도록 보호하는 역할을 합니다.

이 때 샤페로닌이 보호할 수 있는 형태의 단백질이 있고 그렇지 못한 것이 있는데, 가역적 변성을 하는 구형의 짧은 단백질들은 샤페로닌에 의해 보호가 되지만 길이가 긴 섬유상 단백질들은 샤페로닌이 보호할 수 없습니다.

변성 이후 복원할 수 없는 단백질들은 유비퀴틴을 붙여 조면소포체 밖으로 배출하면, proteasome이 이를 확인하여 분해해버립니다.

 

4차 구조는 두 개 이상의 3차 구조가 형성하는 구조를 말합니다. 이 때 작용하는 힘 역시 이황화결합, 소수성 상호작용, 이온 결합, 수소 결합 등이 있습니다.

이 때 이황화결합은 협동효과를 유발하지 않습니다.

나머지들이 협동효과를 무조건적으로 유발하는 것은 아니지만 협동효과가 발동되기 위해서는 소수성 상호작용, 이온 결합 또는 수소 결합이 작용해야 합니다.

 

4차 구조의 대표적 예시로 헤모글로빈(Hb)이 있습니다.

헤모글로빈은 알파글로빈 2개와 베타글로빈 2개로 이루어져있습니다.

이 때 글로빈 단백질 하나, 미오글로빈이 3차 구조에 해당합니다. 글로빈 단백질 각각에는 헴 단백질이 들어있는데, 여기에는 철 이온이 들어있습니다.

(또한 적혈구에는 히스티딘이 포함되어 있는데 이를 통해 적혈구는 체내 pH에서 완충작용을 할 수 있습니다.)

 

+ 흡광도 예시는 다음과 같습니다.

ex ) 엽록소는 Mg2+ 이온을 포함하며 670nm의 파장을 흡수합니다.

ex ) 헤모글로빈은은 Fe2+ 이온을 포함하며 헤모글로빈의 포피린은 560nm의 파장을 흡수합니다.

ex ) 시토크롬은 Fe2+, Fe3+ 이온을 포함하며 400nm의 파장을 흡수합니다.

 

 

협동 효과는 헤모글로빈의 꺾인 구조가 직선형 구조로 변경되어 산소와 잘 결합할 수 있도록 되는 효과를 말합니다.

헤모글로빈의 Fe2+는 2개의 결합이 가능한데 한쪽은 글로빈의 His와 결합하고 나머지 한쪽은 O2와 결합합니다.

그런데 이 때 헤모글로빈은 산소뿐만이 아니라 일산화탄소와도 결합할 수 있습니다.

따라서 일산화탄소가 독성 기체로 사용될 수 있는 것입니다.

 

 

헤모글로빈과 연계되는 개념으로 시기특이적 유전자 발현도 있습니다.

헤모글로빈은 사실 두 가지 종류가 있는데, 알파글로빈 2개와 베타글로빈 2개가 합쳐지면 HbA가 되고, 알파글로빈 2개와 감마글로빈 2개가 합쳐지면 HbF가 됩니다.

베타글로빈은 성인이, 감마글로빈은 태아가 가지는 글로빈 단백질입니다.

간은 감마글로빈 유전자를 발현시키는 전사인자를 가지고 있습니다.

그러나 태아가 성장하게되면 간이 아닌 골수에서 글로빈 유전자를 발현시켜 베타글로빈이 발현됩니다.

(= 시기특이적 유전자 발현)

 

HbF가 HbA보다 산소 친화도가 높습니다. (같은 O2 농도에 대해 포화도가 더 높음)

 

 

분리정제학

분리정제학은 단백질들의 특이활성도를 높여 찾고자 하는 단백질을 찾아가는 과정입니다.

이 때 위에서 언급한 섬유성 단백질들은 분리정제학으로 찾을 수 없고, 구형의 친수성 단백질만을 사용할 수 있습니다.

분리정제학에는 4가지의 방법이 있습니다.

 

첫 번째로, 염석은 염석 염을 이용하여 낮은 용해도의 단백질부터 높은 용해도의 단백질 순서로 침전시키는 방법입니다.

 

+ 과량의 염이 투여되면 막이 형성되어, 단백질이 물과 접촉하지 못하게 되어서 다시 용해도가 감소 및 침전됩니다.

+ 투석은 실험 과정에서 친수성 용질(염)을 제거하는 과정입니다.

 

 

두 번째로 크로마토그래피는 고정상에 대한 이동상(물질)의 이동 속도 차이를 이용하여 단백질을 찾는 방법입니다.

이온교환 크로마토그래피, 관 크로마토그래피(겔 여과=크기배제, 친화성), 얇은막 크로마토그래피가 있습니다.

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(1) 이온교환 크로마토그래피는 아미노산의 등전점과 pH를 이용하여 찾는 방법이며, 세 가지의 유형이 있습니다.

 

먼저 단백질 1개에 완충액의 pH를 바꾸어 구하는 종류가 있습니다.

구슬에 양이온이 붙어있으면 양이온 크로마토그래피라고 부르고 음이온 교환이 발생합니다.

구슬에 음이온이 붙어있으면 음이온 크로마토그래피라고 부르고 양이온 교환이 발생합니다.

용액의 pH가 낮다는 것은 양전하성이 강해지고 음전하성이 약해지는 것입니다.

용액의 pH가 높다는 것은 양전하성이 약해지고 음전하성이 강해지는 것입니다.

각각의 용액에서 280nm 흡광도를 측정할 때 pH가 낮은 용액이 양이온 크로마토그래피에 더 많이 붙습니다.

염의 농도가 증가할수록 단백질과 (양이온 크로마토그래피 기준) 양이온 수지의 결합이 저해됩니다.

 

그 다음 문제에 등전점이 주어지고 단백질은 여러 가지인 경우가 있습니다.

예를 들어 어떤 단백질의 등전점이 10이라고 할 때, 양이온 크로마토그래피로 이 단백질을 선별하는 과정에 대해 생각해봅시다.

- 초기 완충액의 pH는 10보다 높게 설정하고, 그러면 양이온 구슬에 붙게 됩니다.

  예를 들어 pH를 11로 잡으면, 등전점의 pH가 11보다 큰 단백질들은 모두 떨어져나가게 됩니다.

- 두 번째 완충액은 10보다 작거나 같게 설정합니다.

  그러면 구하는 단백질이 양전하를 띠므로 구슬에서 떨어지게 됩니다.

 

마지막으로 여러 가지 단백질들의 등전점을 비교하는 유형의 문제가 있습니다.

여러 가지 단백질의 280nm에서의 흡광도 peak가 시간에 따라 다르게 나타나는 그래프가 주어집니다.

등전점이 낮은 단백질들은 음전하성이 강하고, 등전점이 높은 단백질들은 양전하성이 강하기 때문에 양이온 구슬에서 먼저 떨어지는 단백질일수록 등전점이 높은 단백질임을 알 수 있습니다.

반대로 나중에 떨어지는 단백질일수록 등전점이 낮은 단백질입니다.

 

(2) 관 크로마토그래피는 관의 길이가 길수록 (구분이 잘 되므로) 해상도가 높으며, 다음과 같은 종류들이 있습니다.

 

겔여과크로마토그래피(크기배제 크로마토그래피)의 경우 공극을 가지고 있어서 크기가 큰 물질들은 구슬 구멍 속에 들어갈 확률이 적으므로 빨리 떨어져나오고, 크기가 작은 물질들은 천천히 떨어져나오는 특성을 이용하는 것입니다.

분획수가 낮은 것들은 관심 대상이 아니고, 분획수가 높은 것들 중 목적 단백질이 있습니다.

갤여과크로마토그래피의 장점은 단백질을 변성시키지 않고도 목적 단백질을 찾을 수 있다는 것입니다.

 

+ 크기에 따라 분류하는 방법이므로 해상도가 매우 낮다는 단점이 있어서,

  크기배제 크로마토그래피로 단백질의 크기를 (몇량체인지) 구하고,

  그 다음 전기영동을 같이 이용하여 추가적인 정보를 알아내는 것이 일반적입니다.

 

친화성 크로마토그래피는 물질 간의 친화성의 차이를 이용하는 크로마토그래피 기법으로, 다음의 예시가 있습니다.

- 구슬에 글루타티온이라는 물질이 붙고, 여기에 GST(Glutathione S Transferase)가 100% 붙고,

  여기에 물질 X가 붙고, 여기에 붙는 목표 단백질 Y가 무엇인지를 얻고자 합니다.

- 구슬에 붙는 Ni2+ 이온에 Histidine은 100% 결합합니다. 여기에 결합하는 물질 X에,

  결합하는 목표 단백질 Y가 무엇인지를 얻고자 합니다. (니켈 대신 이미다졸(His의 질소고리)이 사용되기도 합니다.)

- 비오틴과 아비딘은 100% 결합합니다.

 

특정 유전자 X에 작용하는 전사인자 Y를 분리하기 위한 크로마토그래피 실험을 수행하기도 합니다.

전사인자 Y가 발현되고 있는 세포에서 전체 단백질을 분리해서 컬럼에 통과시킵니다.

어찌되었든 친화성 크로마토그래피에서, 친화성이 낮은 것들은 빨리 떨어져 나와 분획수가 낮은 것들에 들어가고,

친화력이 강한, 목표로 하는 물질은 리간드 용액을 부어 용출시켜 얻어냅니다.

 

소수성 상호작용 크로마토그래피는 친수성 분자는 구슬로부터 먼저 떨어지고 소수성 분자는 나중에 떨어진다는 특성이 있습니다.

 

(3) 얇은막 크로마토그래피(TLC)는 (모세관 현상을 통해 이동하는) 색소의 분리를 이용하여 물질을 구분합니다.

고정상 물질의 색소와 이동상 물질의 색소의 친화도 차이에 의해 발생하는 분리입니다.

예를 들어 색소의 이동량이 많다면 해당 물질은 이동상과의 친화도가 높으며, 색소의 이동량이 적다면 해당 물질은 고정상과의 친화도가 높다는 것입니다.

 

얇은막 크로마토그래피와 관련한 기출문제로 엽록소의 분리에 관한 문제가 출제된 적이 있습니다.

엽록소의 색소혼합물을 분리하는 것입니다.

전개액(크로마토그래피가 수행되는 용매)은 여러 물질이 섞여서 나오기 때문에 물질 자체는 복잡하기만 하고 중요하지는 않습니다.

 

역상이라는 말이 없을 경우 순상 크로마토그래피로, 이 때 전개액은 소수성입니다.

전개액이 소수성이라면 한계전선에 가장 가깝게, 즉 가장 멀리 이동한 물질이 가장 큰 소수성일 것입니다.

반대로 "역상" 크로마토그래피라고 문제에 제시해주면, 이 경우 전개액은 친수성이므로, 가장 멀리 이동한 물질이 가장 큰 친수성입니다.

 

크로마토그래피 수행 후 옆으로 돌려서 2차 전개를 하는 경우도 있는데, 이 때는 전개액의 물질 특성이 바뀌어야 합니다.

+ 캘빈이 CO2가 포도당으로 합성되는 과정을 밝힐 때도 이 실험을 이용했습니다.

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세 번째로, 전기영동이 있습니다.

 

SDS-PAGE는 단백질 혼합용액에서 단백질들을 분리할 때 가장 많이 이용되는 방법입니다.

단백질은 전하를 띠지 않으므로 먼저 환원제(주로 beta-ME)와 SDS를 같이 처리하여 (2개의 아미노산 당 1개에) 음전하를 띠는 단백질로 만들어줍니다.

그러면 전기영동 시 단백질들이 +극으로 이동합니다.

 

(이종다당체 파트에서) 핵산을 전기영동 할 때는 아가로오스겔을 이용한다고 했었습니다.

반면, 단백질을 전기영동 할 때는 폴리아크릴아마이드겔과 비스아크릴아마이드겔을 이용합니다.

이 둘을 매개하는 물질은 APS입니다. (APS의 TEMED가 이들을 교차연결시킴)

 

전기영동에는 압축겔 부분과 분리용겔이 있는데, 물질들은 압축겔에서 분리용겔 방향으로 이동합니다.

압축겔(저농도의 아크릴아마이드와 낮은 pH)에서는 Tris-HCl-글리신 조합에 대해 알아야합니다.

HCl은 큰 음전하를 가지기 때문에 분리용겔쪽에 위치하게 되고, 글리신은 가장 적은 음전하를 띠기 때문에 음극으로부터 많이 이동하지 못합니다.

그러면 단백질이 가운데에 위치됨으로써 보호가 되는 것입니다.

즉, 압축겔에서는 단백질이 노출이 되지 않기 때문에 절편의 크기가 영향을 주지 않습니다.

분리용겔(고농도의 아크릴아마이드와 높은 pH)에서는 절편의 크기가 크면 이동속도가 느리게 됩니다.

즉, 절편의 크기에 따라 이동속도의 차이가 발생하는 부분은 분리용겔입니다.

 

** 전기영동 중에서 비변성화겔을 사용하는 경우가 있는데, 이것은 전기영동을 단위체가 아닌 복합체 상태(ex : 이량체)로 시키는 경우입니다. (beta-ME를 처리 안함)

몇량체인지 확인하기 위해서 비변성겔을 이용한다고 생각하면 됩니다.

 

 

 

 

네 번째로, 등전점 전기영동이 있습니다.

가로축에 pH를 사용하여 (ex : 왼쪽은 낮은 pH, 오른쪽은 높은 pH를 유지) 물질이 낮은 pH에 갔으면 양전하성을 띠어 반대로 이동하고, 높은 pH에 갔으면 음전하성을 띠어 다시 반대로 이동하기 때문에 마지막에 등전점의 pH에 위치하게 됩니다.

 

여기에 추가적인 분리 기준을 한 가지 더 도입하여 이차원 크로마토그래피(전기영동)를 만들 수 있는데,

이차원 크로마토그래피는 단백질들이 한 가지 메커니즘으로는 전부 분리하기 어렵기 때문에 두 가지의 분리 기준을 동시에 사용하는 방법입니다.

 

** 이차원 크로마토그래피는 단백질들의 3차 구조가 유지된 상태로 사용합니다.